The targeted anti-Salmonella bacteriophage attenuated the inflammatory response of laying hens challenged with Salmonella Gallinarum

Poultry Science
Volume 102, Issue 1, January 2023, 102296

 

 

2022 The Authors. Published by Elsevier Inc. on behalf of Poultry Science Association Inc.

This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Received June 22, 2022.

Accepted October 22, 2022.

Corresponding author: kjs896@kangwon.ac.kr

 

 

 

ABSTRACT

 

닭 장티푸스는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)에 의해 발생하는 심각한 질병으로 산란계 농장에서 상당한 폐사율 mortality과 질병감염율 morbidity을 나타냅니다.

현재 연구는 박테리오파지를 사용하여 산란계의 감염을 통제하는 데 중점을 두고 있습니다.

 

시험 처리구는 다음과 같습니다.

• Control, without challenge;
• NC, S. Gallinarum challenged (SGC);
• B5, 5 mg bacteriophage/kg + SGC;
• B10, 10 mg bacteriophage/kg + SGC.

산란계 실험군의 공장jejunum, 간, 허벅지 근육thigh muscle에서 살모넬라균 배출 Salmonellashedding, 염증 반응, 염증 촉진 사이토카인pro-inflammatory cytokines, toll-like receptor TLR(톨 유사 수용체) 및 heat shock protein HSP(열 충격 단백질)의 유전자 발현을 검증하였습니다.

 

박테리오파지의 첨가는 d 3, 7, 14에서 배설물 내 S. Gallinarum의 양을 감소시켰습니다.

d7에서 S. Gallinarum 수준은 B5보다 B10에서 더 낮았습니다.

박테리오파지의 첨가는 d14에서 난관, 비장 및 맹장에서 S. Gallinarum의 수준을 감소시켰습니다.

 

박테리오파지의 첨가(B5, B10)는 14일째에 난관, 비장 및 맹장에서 S. Gallinarum의 수준을 감소시켰습니다.

NC처리구는 PC 및 B10 처리군에 비해 상대적 비장 중량이 증가한 것으로 나타났습니다.

SGC 처리군 중,

NC처리군은 B5처리군에 비해 IL-4의 유전자 발현이 더 높았으며, B5 및 B10 처리군에 비해 인터페론(IFNg), TLR4 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 유전자 발현이 더 높고, 공장에서의 경우 B10처리군에 비해 heat shock protein HSP27의 유전자 발현이 더 높습니다.

B10 처리군의 공장에서 B5처리군에 비해 TLR4 및 TNF-a의 mRNA 발현을 감소시켰습니다.

NC처리군은 간에서 HSP27, TLR4 및 TNF-a의 가장 높은 유전자 발현을 보여주었다.

B10처리군의 간에서 B5처리군에 비해 HSP27의 mRNA 발현이 더 낮은 것으로 나타났습니다.

더욱이,  B5와 B10처리군의 근육에서 NC처리군에 비해 IFNg와 HSP27이 상향조절되었습니다.

결론적으로, 박테리오파지는 산란계의 S. Gallinarum 감염을 통제하고 산란계의 수평 오염을 낮추는 데 효과적임을 시사할 수 있습니다.

 

Key words: immunity, cytokine, challenge, liver, fowl typhoid

 

 

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INTRODUCTION

 

살모넬라는 농장 동물의 내장에 흔한 서식자입니다(Kogut et al., 2020; Kairmi et al., 2022).

닭 장티푸스는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)에 의해 발생하는 심각한 질병으로, 특히 brown-shell egg layers 에서 폐사율mortality과 질병감염율morbidity이 높습니다(Seo et al., 2019).

S. Gallinarum의 발병은 산란계 농장에서 자주 발생하여 상당한 경제적 손실을 입혔습니다(Seo et al., 2019).

S. Gallinarum은 장에서 시작하여 점차적으로 다른 기관을 감염시키는 전신 감염이 있는 조류 특유의 병원체입니다(Hosseindoust et al., 2018).

S. Gallinarum 감염을 통제하기 위한 산란계의 면역 반응은 명확하게 이해되지 않았습니다.

그러나 장세포, 맹장 편도선, Peyer's patch가 S. Gallinarum의 첫 번째 표적이라는 것은 이미 알려져 있습니다(Setta et al., 2012).

염증 반응은 장내에서의 지질다당류 lipopolysaccharides의 반응과 S. Gallinarum의 flagella서 시작됩니다.(Gast et al., 2021).

감염의 다음 단계에서 S. Gallinarum은 점막 대식세포mucosal macrophages  또는 수지상 세포 dendritic cells를 통해 다른 기관으로 운반됩니다(Sutton et al., 2022).

그러므로 결과를 줄이기 위해서는 장의 첫 번째 단계에서 살모넬라 감염을 통제하는 것이 필요합니다.

S. Gallinarum에 대한 저항성을 개선하면 폐사율, 질병감염율 및 전파를 감소시켜 상당한 경제적 손실을 줄일 수 있습니다.

 

위생도 개선, 항생제, 백신 투여 등이 살모넬라 감염을 효과적으로 통제하는 방법이 되어 왔다(Setta et al., 2012; Seo et al., 2019; Gast et al., 2021; Lee et al., 2021).

그러나 박테리아 저항성과 계란의 항생제 잔류로 인해 전 세계적으로 항생제 사용이 제한되었습니다.

또한, 항생제의 비선택적 지정은 장내 미생물군을 방해하고 설사 발생률을 증가시킬 수 있는 여러 유익한 박테리아가 제거됩니다(Kairmi et al., 2022).

이와 관련하여, 세계적 관심은 산란계의 장티푸스 발생을 통제하기 위한 새로운 보호 전략을 모색하는 쪽으로 옮겨졌습니다.

그러나 항생제는 가금류 농장에서 살모넬라에 대한 효과적인 방제 전략의 일환으로 오랫동안 사용되어 왔으며, 비항생제 제품을 사용하면 농장에서 살모넬라의 수평 전파를 크게 줄일 수 있습니다.

일부 감염된 산란계는 장기적으로 무증상 보균자가 되어 살모넬라균을 감염되지 않은 층으로 옮기기 때문에 수평 전파는 가금 장티푸스 질병 역학에서 매우 중요합니다.

이는 종계장에서 오염된 계란을 통해 살모넬라균을 수직 전염시키는 사육 농장에서 중요한 문제입니다.

프로바이오틱스(Hosseindoust et al., 2018), 박테리오파지(Adhikari et al., 2017; Choi et al., 2020; Lee et al., 2021)와 같은 비항생제 인자 nonantibiotic factors의 사용은 위장관을 통해 살모넬라 감염 통제에 예방 및 치료 효과를 보여주었습니다.

표적 병원균을 제거하는 박테리오파지의 특수성은 감염위험의 산란계에 사용되는 중요성을 증가시킵니다.

또한, 조류 장티푸스 발병 초기 단계에서 질병 확산을 예방하기 위해 박테리오파지를 장기간 사용할 수 있다.

생산 기술의 지속적인 증가로  pH 안정성 박테리오파지가 얻어졌습니다.

진화된 박테리오파지(BP)는 장 내강 환경에서 생존하고 증식할 수 있으며 육(Huang et al., 2022), 산란계(Adhikari et al., 2017; Lee et al., 2021), 돼지(Lee et al., 2016; Hosseindoust et al., 2017)의 살모넬라균을 표적으로 삼습니다. 

박테리오파지는 설사의 중증도와 위장관의 병원성 성장을 완화하기 위해 단일 또는 혼합 형태로 투여될 수 있습니다.

본 연구는 S.Gallinarum에 감염되는 산란계에서의 질병 통제, 면역 상태, Salmonella spp, 성장에 대한 식이 항-S.Gallinarum 박테리오파지의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다.

 

 

 

MATERIALS AND METHODS

 

Animals and Experimental Design

 

실험은 강원대학교 동물기관관리위원회(KW-210503-6)의 승인을 받았습니다.

총 24수(40주령) Hy-Line Brown 산란계를 케이지에 6개 반복하여 4개 처리로 분산시켰습니다.

산란계가 S. Gallinarum 음성인지 확인하기 위한 인공접종을 시작하기 전에 배설물 샘플을 수집했습니다.

처리구는 다음과 같습니다.

• Control, without challenge;
• NC, S. Gallinarum challenged (SGC);
• B5, 5 mg bacteriophage/kg + SGC;
• B10, 10 mg bacteriophage/kg + SGC.

실험은 14일 동안 진행되었다.

사료설계는 Hy-Line 영양소 사양 핸드북에 나열된 영양소 요구 사항을 충족하거나 초과하는 모든 영양소를 제공하도록 구성되었습니다.

7일 적응 후, S. Gallinarum 균주 KVCC BA 0700722 인공감염을 d 0에 3.7 × 10⁸ CFU로 oral gavage 으로 수행했습니다.

 

 

 

RESULTS

 

 

Intestine and Organ Microflora

 

배설물excreta과 맹장 소화물cecum digesta에 존재하는 살모넬라 종의 개체수는 Table 2. 에 나와 있습니다.

 

 

NC 그룹의 산란계는 7일째 배설물excreta에서 가장 높은 살모넬라균 개체수를 나타냈습니다(P < 0.05).

B5 및 B10 처리구는 PC에 비해 살모넬라균 개체수가 더 높은 것으로 나타났습니다(P < 0.05).

 

14일째에 SGC 처리구는 PC 처리구에 비해 맹장 및 배설물의 Salmonella 종 개체수가 더 높은 것으로 나타났습니다.

B5 및 B10 처리구는 NC에 비해 살모넬라균 개체수가 더 낮은 것으로 나타났습니다(P < 0.05).

 

 

S. Gallinarum의 수준을 배설물, 수란관, 비장 및 맹장에서 평가되하였습니다(Table 3).

 

 

 

 

박테리오파지 첨가는 3일, 7일, 14일에 배설물에서 S.Gallinarum의 수준을 감소시켰습니다(P < 0.01).

S. Gallinarum의 수준은 d7에서 B5보다 B10에서 더 낮았습니다.

박테리오파지 첨가는 14일째에 난관, 비장 및 맹장에서의 수준을 감소시켰습니다(P < 0.01).

 

 

Gene Expression in Jejunum

 

PC 처리는 다른 처리와 비교하여 공장에서 IL-4, IL-6, IFNg, HSP27, TLR4 및 TNF-α의 가장 낮은 mRNA 발현을 보여주었습니다(P<0.05, Figure 1).

 

SGC 처리군 중 NC 처리군은 B5에 비해 IL-4의 유전자 발현이 높았고,

B5와 B10에 비해 IFNg, TLR4, TNF-α의 유전자 발현이 높았으며,

B10에 비해 HSP27의 유전자 발현이 더 높았다.

B10의 식이 보충은 B5 처리에 비해 TLR4 및 TNF-α의 mRNA 발현을 감소시켰습니다(P<0.05).

B5와 B10 사이에는 IL-4, IL-6, IFNg 및 HSP27의 유전자 발현에 차이가 없었습니다.

 

 

Gene Expression in Liver

 

PC 처리는 다른 처리와 비교하여 공장에서 IL-4, IL-6, IFNg, HSP27, TLR4 및 TNF-α의 가장 낮은 mRNA 발현을 보여주었습니다(P<0.01, Figure 2).

 

SGC 처리구에서는 IL-4, IL-6, IFNg 유전자 발현에는 차이가 없었으나, NC 처리구에서는 B5, B10에 비해 HSP27, TLR4, TNF-a의 유전자 발현이 높게 나타났다.

B10처리구가 B5 처리에 비해 HSP27의 mRNA 발현이 더 낮았지만(P < 0.05), TLR4와 TNF-a의 유전자 발현에는 차이가 관찰되지 않았습니다.

 

 

Gene Expression in Muscle

 

PC 처리구는 다른 처리구와 비교하여 공장에서 IL-4, IL-6, IFNg, HSP27, TLR4 및 TNF-α의 가장 낮은 mRNA 발현을 보여주었습니다(P < 0.01, Figure 3).

 

 

공격을 받은 실험군 중에서 IL6의 유전자 발현은 B5에 비해 NC 처리에서 상향조절되었습니다.

더욱이, IFNg 및 HSP27은 B5 및 B10에 비해 NC 처리에서 상향조절되었으나, TLR4 및 TNF-α의 mRNA 유전자 발현에는 영향을 미치지 않았다.

 

 

 

DISCUSSION

 

장은 장내 미생물군을 통해 면역체계에 상당한 영향을 미치는 중요한 기관이다(Hosseindoust et al., 2020; Kogut et al., 2020; Huang et al., 2022).

phase 2 에 비해 phase 1에서 살모넬라 수의 감소는 박테리오파지의 즉각적인 효과 때문일 수 있습니다.

박테리오파지는 대부분 지연된 항병원성 효과를 가지며 장기간 보충 기간 동안 더 나은 성능을 보이는 것으로 제안되었습니다(Lee et al., 2021).

서로다른 첨가수준의 박테리오파지 처리구의 d14 사이에 배설물과 맹장의 살모넬라 수에 차이가 없다는 사실은 두 번째 단계에서 더 낮은 용량에서도 박테리오파지 보충의 효율성을 보여줄 수 있습니다.

보다 구체적으로, 우리의 연구 결과는 배설물 내 S. Gallinarum 수의 급격한 감소가 계군 사이에서 S. Gallinarum의 수평 이동을 감소시킬 수 있음을 보여줍니다.

가금 장티푸스 질병의 방제는 주로 배설물을 통한 교차 감염을 제거하기 때문에 감염된 새를 무리에서 제거하는 것입니다.

장, 간, 비장이 S. Gallinarum 증식의 잠재적 중심지인 것으로 알려져 있습니다(Da Silva et al., 2016; Zhou et al., 2020).

이와 일치하여, 공격을 받은 산란계에서 박테리오파지 첨가를 통해 난관, 비장 및 맹장에서 S.Gallinarum의 상대적으로 수준을 감소시켰습니다.

박테리오파지 처리 간의 미미한 차이는 산란계가 질병의 두 번째 단계에서 더 낮은 용량의 박테리오파지를 필요로 한다는 사실과 관련될 수 있습니다.

S. Gallinarum은 장세포에서 순환계로 침투한 후 비장, 간 등 전신 부위로 침투합니다(Da Silva et al., 2016).

내부 장기에 증식된 S. Gallinarum은 면역 체계를 자극하고 염증을 증가시킵니다.

이러한 S. Gallinarum 개체수의 감소가 어떻게 간이나 비장과 같은 내부 장기에서 나타날 수 있는지 설명하기는 어렵지만, 이러한 효과를 설명하는 데에는 두 가지 이유가 있을 수 있습니다.

첫째, 주요 증식 부위인 장내 S. Gallinarum 제거에 있어서 박테리오파지의 역할은 염증 반응을 감소시키고 산란계의 면역체계를 도와 전신 기관에서 S. Gallinarum을 제거하는 데 도움을 줄 수 있다.

둘째, 그러나 현재 연구에서는 장기 내 박테리오파지 수를 측정하지 않았으며, 박테리오파지는 살모넬라균에 침투하여 이를 운반체로 사용하여 전신 기관으로 이동하여 표적 병원체를 제거할 수 있습니다.

 

 

장의 병원성 병원체 관련 분자는 TLR에 영향을 주어 대식세포에서 핵 인자-kB의 활성화와 후속 염증 반응을 시작합니다(Kamimura et al., 2017; Sutton et al., 2022; Tong et al., 2022).

TLR 자극은 TNF-a, IL-1b 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 증가시킵니다(Al-Zghoul and Mohammad Saleh, 2020).

그람 음성 박테리아인 살모넬라(Salmonella)는 병원성 LPS에 가장 민감한 TLR인 TLR4를 자극하는 LPS를 생성합니다.

NC처리구에 비해 박테리오파지를 먹인 처리구의 공장과 간에서 TLR4 발현이 감소했습니다.

이는 신호 전달이 살모넬라 감염과 장 내 S. Gallinarum의 세포주위 존재에 크게 의존한다는 것을 의미합니다.

간과 공장에서는 B5와 B10 사이의 TLR4 유전자 발현에 차이가 없었으나, B10은 B5 처리에 비해 공장에서 하향조절된 TLR4 유전자 발현을 보였다.

현재 성과는 장내 박테리오파지의 고용량 투여의 중요성을 정확히 지적하고 있으며, 이는 S. Gallinarum의 개체수를 더 높은 효율성으로 감소시킬 수 있습니다.

하향조절된 공장 TLR4 유전자 발현은 장내 S. Gallinarum 및 TLR 자극인자의 감소와 연관될 수 있습니다.

이러한 사건은 까다로운 환경에서 더 많은 양의 박테리오파지를 보충해야 한다는 요구 사항을 강조합니다.

박테리오파지는 성장 성능을 높이고 동물 건강을 개선하는 새로운 유형의 동물 항병원제입니다(Adhikari et al., 2017; Hosseindoust et al., 2017, 2018; Lee et al., 2021).

현재 연구에서 TLR4 및 염증성 사이토카인의 유전자 발현에 대한 박테리오파지의 예방 역할은 간과 근육보다는 공장에서 상대적으로 더 높았습니다.

S. Gallinarum 감염은 감염되지 않은 대조군에 비해 전염증성 사이토카인 IL4, IL6, TNF-a 및 IFN-g mRNA 수준을 증가시켰는데, 이는 S. Gallinarum 감염이 장에서 염증 반응을 크게 유발했음을 나타냅니다.

사료내 박테리오파지 첨가 처리구의 공장 및 간에서 TLR4, IFNg 및 TNF-α의 발현을 감소시켜 염증반응을 완화시키고 면역학적 변화를 유지하는데 기여하였다.

급성 염증 중에는 세포 및 분자 조정을 통해 손상 강도가 감소했습니다(Hosseindoust et al., 2022).

염증성 사이토카인은 선천성 면역 반응 과정의 주요 중재자입니다(Hosseindoust et al., 2022).

면역 반응은 IL-1b, IL-6, TNF-α 및 IFNg를 포함한 TLR4 자극 및 전염증성 사이토카인 생성에 의해 시작됩니다(Alizadeh et al., 2016).

 

본 연구에서는 NC에 비해 박테리오파지가 급여된 산란계의 간과 공장에서 TNF-α의 발현이 하향조절되어 더 낮은 염증 반응을 보였다.

TLR 유발 장 염증에 대한 박테리오파지의 보호 효과는 S. Gallinarum의 감소 및 신호 효과와 연관될 수 있습니다.

살모넬라균 감염의 병변은 균혈증으로 인해 간 및 비장 조직에 나타나며, 이는 유기체 내로 광범위하게 퍼진다(Shao et al., 2013; Da Silva et al., 2016; Choi et al., 2020; Lee et al., 2021) ).

간의 독특한 혈관계는 장에서 분비되는 병원체 관련 분자뿐만 아니라 간세포의 위험 관련 분자 패턴에 의한 염증에 대한 민감도를 나타냅니다(Lee et al., 2021).

병원체 관련 분자의 활성화는 전염증성 사이토카인의 생성을 증가시킵니다(Xie et al., 2002).

간은 전염증성 사이토카인의 영향을 받아 급성기 단백질을 합성하는 주요 기관 중 하나입니다(Da Silva et al., 2016; Tong et al., 2022).

현재 연구에서 간 및 비장 중량의 증가는 급성기 단백질 및 IL-6, TNF-α 및 IFNg를 포함한 염증성 사이토카인의 상향 조절과 관련될 수 있습니다.

S. Gallinarum은 비장의 염증을 증가시켰으며 이는 비대 또는 비장종대를 동반했습니다.

출혈성 비장이나 대리석 비장의 세균 감염 진단은 주로 비장의 색상, 크기, 육안적 병변을 기준으로 관찰할 수 있다(Oh et al., 2010).

 

살모넬라 균 감염은 PC에 비해 NC 치료에서 비장 비대가 78% 더 높은 중량으로 나타났습니다.

감염, 간경변, 백혈병 및 부상은 비장 크기가 증가하는 주요 원인입니다(Gent and Blackie, 2017).

비대증은 살모넬라균에 의해 유도된 세포내 염증성 사이토카인 생산에 대한 비장의 반응으로, 이는 비장 병변과 증식을 초래합니다(Oh et al., 2010; Choi et al., 2020).

이와 일치하여, S. Typhimurium에 감염된 산란계(Oh et al., 2010; Tian et al., 2018)는 간과 비장의 상대적 무게가 더 높은 것으로 나타났습니다.

우리 연구에서 산란계의 간과 비장의 상당한 체중 변화는 살모넬라균 공격이 효과적으로 수행되었음을 나타냅니다.

결론적으로, 우리의 결과는 박테리오파지의 첨가가 산란계에서 S. Galinarum 감염을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났으며, 비항생제 농업 발전을 위한 경로로 투여될 가능성이 있습니다.

배설물에서 S. Galinarum을 제거하면 농장 규모의 산란계 간 교차 감염을 줄일 수 있는 가능성이 나타납니다.

 

 

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