The targeted Anti-Salmonella bacteriophage attenuated the inflammatory response of laying hens challenged with Salmonella Gallinarum

 

 

ABSTRACT

가금티푸스는 Salmonella Gallinarum에 의해 발생하는 심각한 질병으로 산란계 농장에서 상당한 폐사율과 높은 질병 방병율을 보입니다.

이번 연구는 Anti-Salmonella spp. 박테리오파지를 사용하여 산란계의 감염을 통제하는 데 초점을 맞추고 있습니다.

 

• PC 비교구, 공격접종;
• NC 처리구, S. Gallinarum 공격접종(SGC);
• B5, 0.5g(0.05%) 박테리오파지/kg + SGC;
• B10, 1.0g(0.1%) 박테리오파지/kg + SGC

- 살모넬라 발산, 염증 반응, 전염증성 사이토카인의 유전자 발현, TLR(toll-like receptor) 및 Jejunum(공장), 간 및 허벅지 근육의 열 충격 단백질(HSP)을 산란계에서 테스트했습니다.

- 박테리오파지의 첨가는 d3, d7 및 d14의 분변에서 S. Gallinarum을 감소시켰습니다.

- 분변내 S. Gallinarum은 d7에서 B5보다 B10에서 더 낮았습니다.

- 박테리오파지의 첨가는 d14에서 oviduct(난관), spleen(비장) 및 cecum(맹장)에서 S. Gallinarum을 감소 시켰습니다.

- S. Gallinarum 공격접종한 NC처리구는 PC비교부 및 B10 처리구에 비해 상대적으로 spleen(비장) 무게가 증가한 것으로 나타났습니다.

- SGC 처리 중 NC비교구는 B5처리구에 비해 IL-4의 유전자 발현이 더 높게 나타났으며, B5 및 B10 처리구에 비해 인터페론(IFNg), TLR4 및 종양 괴사 인자-a(TNF-a)의 유전자 발현이 더 높게 나타났으며, Jejunum(공장)에서 B10처리구에 비해 SP27의 유전자 발현이 더 높게 나타났습니다. B10처리구의 박테리오파지 첨가는 Jejunum(공장)에서 B5 처리와 비교하여 TLR4 및 TNF-a의 mRNA 발현을 감소시켰습니다.

- NC비교구는 간에서 HSP27, TLR4 및 TNF-a의 가장 높은 유전자 발현을 나타냈습니다.

- B10처리구의 박테리오파지 첨가는 간에서 B5처리구에 비해 HSP27의 mRNA 발현이 더 낮았습니다.

- 더욱이, IFNg 및 HSP27은 근육에서 B5 및 B10과 비교하여 NC 처리에서 상향 조절됐습니다.

 

결론적으로 박테리오파지는 산란계의 S. Gallinarum 감염을 제어하고 산란계의 수평 전파 감염을 낮추는 데 효과적임을 시사할 수 있습니다.

 

 

1. INTRODUCTION

 

살모넬라는 가축의 장에서 흔히 서식하는 종입니다.(Kogut et al., 2020; Kairmi et al., 2022)

 

가금티푸스는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)에 의해 발생하는 심각한 질병으로 특히 Brown egg layer종에서 높은 폐사율과 질병 감염율을 보입니다. (Seo et al., 2019)

 

S. Gallinarum의 발병은 산란계 농장에서 자주 발생하여 상당한 경제적 손실을 초래 했습니다. (Seo et al., 2019)

 

S. Gallinarum는 전신 감염이 장에서 시작되어 점차 다른 기관을 감염시키는 양계 특이 병원체입니다. (Hosseindoust et al., 2018)

 

S. Gallinarum 감염을 제어하기 위한 산란계의 면역 반응은 명확하게 밝혀지지 않았지만 장세포, 맹장편도, Peyer's patch가 가금티푸스의 첫 번째 타겟이라는 것은 이미 알려졌습니다. (Setta et al., 2012)

 

염증 반응은 S. Gallinarum 존재의 리포폴리사카라이드와 편모에 대한 반응으로 장에서 시작됩니다. (Gast et al., 2021)

 

감염의 다음 단계에서 S. Gallinarum은 점막 대식세포 또는 수지상 세포를 통해 다른 기관으로 운반됩니다. (Sutton et al., 2022)

 

따라서 결과를 줄이기 위해서는 장의 첫번째 방어선에서 살모넬라 감염을 제어하는 것이 필요합니다.

S. Gallinarum에 대한 산란계의 질병 저항성을 개선하면 폐사율, 질병 감염율 및 전염을 감소시켜 상당한 경제적 손실을 줄일 수 있습니다.

 

개선된 위생 상태, 항생제 및 백신 투여는 살모넬라 감염을 통제하는 효과적인 방법이었습니다 (Setta et al., 2012; Seo et al., 2019; Gast et al., 2021; Lee et al., 2021).

 

그러나 달걀에 남아 있는 박테리아 내성과 항생제는 전 세계적으로 항생제 사용을 제한했습니다.

또한 항생제의 비선택적 균 사멸은 장내 미생물군을 방해하고 설사 발병률을 증가시킬 수 있는 몇 가지 유익한 박테리아를 제거합니다. (Kairmi et al., 2022)

 

이와 관련하여 세계적 관심은 산란계에서 가금티푸스 발병률을 제어하기 위한 새로운 방어 전략을 모색하는 것으로 화두입니다.

그러나 가금류 농장에서 살모넬라균에 대한 효과적인 방어 전략의 일환으로 오랫동안 항생제가 사용되어 왔으며 무 항생제 제품을 사용하면 농장에서 살모넬라균의 수평적 전파를 크게 줄일 수 앖습니다.

일부 감염된 산란계가 장기간 무증상 보균체가 되어 살모넬라균을 감염되지 않은 층으로 옮기기 때문에 수평 전파는 가금 티푸스 역학에서 매우 중요합니다.

이것은 오염된 계란에 의해 인체에게 살모넬라를 옮기는 종계 농장에서 중요한 문제입니다.

 

프로바이오틱스(Hosseindoust et al., 2018) 및 박테리오파지(Adhikari et al., 2017; Choi et al., 2020; Lee et al., 2021)와 같은 비항생제 인자의 사용은 위장관을 통한 살모넬라 감염 조절에 대한 예방 및 치료 효과를 나타냈습니다.

 

타겟 병원균만 표적 하는 박테리오파지의 특이성은 산란계에서 사용되는 중요성을 증가시킵니다.

또한, 박테리오파지는 가금티푸스 발병 전후에 예방용으로 사용하여 초기 단계에서 질병의 확산을 방지할 수 있습니다.

 

박테리오파지 기술 발전으로 pH에 대한 안정한 박테리오파지가 얻어졌습니다.

개발된 박테리오파지(BP)는 살모넬라균을 타겟으로 육계(Huang et al., 2022), 산란계(Adhikari et al., 2017; Lee et al., 2021), 돼지(Lee et al., 2016; Hosseindoust et al., 2017)의 장내 환경에서 안정하게 생존하고 증식할 수 있습니다.

 

박테리오파지는 설사의 중증도 및 위장관에서의 병원성 성장을 완화시키기 위해 단일 또는 혼합 형태로 투여될 수 있습니다.

 

본 연구는 Salmonella spp. S. Gallinarum 공격접종 이후 양계용 박테리오파지의 첨가로 인한 질병의 관리, 면역 상태, Salmonella spp. 증식 등에 있어서 그 효과를 연구하였습니다.

 

 

2. MATERIALS AND METHODS

 

Animals and Experimental Design(실험 디자인)

: 본 실험은 강원대학교 동물보호이용기관위원회(KW-210503-6)의 승인

- 총 24수(40주령)의 Hy-Line Brown 산란계 4처리, 6반복

- 실험내 공격접종전, 산란계의 S. Gallinarum 음성 확인을 위해 분변 샘플 채취

- 실험은 14일동안 진행하였으며, 사료는 Hy-Line 사양 핸드북에 표기된 영양소 요구 사항 충족하여 제공

- 7일 후, S. Galinarum 균주 KVCC BA 0700722를 d0에서 3.7 x 10^8 CFU로 경구투여

 

 

처리구는 다음과 같다.

PC	비교구, 처리 없음
NC	처리구,S.Gallinarum 공격접종;(SGC)
B5	0.5g(0.05%) bacteriophage/kg +SGC
B10	1.0g(0.1%) bacteriophage/kg +SGC

 

 

 

Organ Samples and RNA Extractions

- 총 RNA는 제조사의 지침(Lee et al., 2021)에 따라 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 Jejunum(공장, 50 mg), Livers(간, 50 mg), Spleens(비장, 100 mg) 검체로부터 분리

- 추출된 RNA는 1mg/ml로 정량화 cDNA 합성은 Improme-II Reverse 전사 시스템(Promega, Fitchburg, MA) 사용 PCR은 Mx3000P 실시간 PCR(Stratagen, LaJolla, CA) 사용

- 결과는 delta-delta법을 이용하여 상대적으로 표현

- 이 과정에서 백신을 도입하여 투입, cDNA 양 조절하여 내부 조절 역할을 유지하게 함(Lee et al., 2021).

- 총 20μL 반응 시스템은 10μL SYBR Premix Ex Taq, 0.8μL 정방향 및 역방향 프라이머(10μL), 0.4μL ROX Reference Dye II (50 £), 2.0mL cDNA template, 6μL DD H2O를 포함하였음

 

 

순환 조건

- 95°C에서 30초,

- 95°C에서 3초 동안 40회 반복 : 변성 단계

- 60°C에서 34초 : 퇴화 단계

- 15초 동안 72°C : 연장 단계.

 

 

 

Salmonella Enumeration

- 7일, 14일에 분변 샘플 채취, 14일에 모든 조류의 맹장 샘플 채취하여 살모넬라 종균을 열거함

- 시료 1g 채취하여 10배로 희석한 후, 혐기성 결균 펩톤 용액과 혼합 희석함(Lee et al., 2021).

- 이후 103~107로 연속적 희석된 0.1mL 시료를 37°C의 인큐베이터 내 멸균된 Flat Xylose lysine deoxycholate agar(Difo aboratories, Franklin Lakes, NJ)에 24시간 동안 도포

- Difco 제공 설명서를 따라 log CFU/g로 표시함

- 시험군은 도살 후 맹장, 분뇨, 비장, 난관을 멸균 튜브에 옮겨 보관, 그리고 모든 시료 분석 전 -80°C 보관

- 멸균된 모르타르에 액체 질소를 주입하여 시료 1개당 약 2g을 균질화 함

- 이후 약 250 mg의 냉동 샘플 분말이 게놈 DNA 추출에 사용

- 게놈 DNA 추출은 QIAamp DNA 대변 미니 키트를 사용하여 수행(독일 Hilden, Qiagen, Hilden).

- 반응 혼합물은 템플릿 DNA 1 uL, Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix(Agilent, Santa Clara, CA) 10 uL, 각 프라이머 0.4 uL, 3차 증류수를 최종 부피 20 mL로 구성한 후, Mx3000P Real-time PCR(Stratagen)을 사용하여 PCR을 수행

- PCR의 상태와 총세균과 S. Galinarum의 프라이머는 Lee et al., 2013 의 방법에 따라 구성

- 총세균과 S. Galinarum의 프라이머 (F-50 - GTATGGTTTAGACGTTT-30, R-50 - TATTCA CGAATCTC-30)

- S. Galinarum의 검출된 Ct 값은 총 세균의 Ct 값으로 정규화한 후 Hoseindoust et al. (2020)이 설명한 방법에 따라 delta-delta Ct 방법을 사용하여 결과를 표현함

 

Organ Weight

- 42주령때 샘플 채짐

- 간과 비장을 채취하여 상대 장기 무게(체중의 백분율)을 계산.

 

Statistical Analysis

- 통계 분석은 SAS(SAS Inst. Inc., Cary NC)의 GLM 절차에 의해 완전히 무작위 설계를 기반 처리

- 산란계는 모든 매개변수에 대한 실험 단위로 간주됨

- 분산 인자 분석은 P < 0.05 통계 수준에서 Tukey 다중 범위 검정을 기반으로 함

 

 

3. RESULTS

 

Intestine and Organ Microflora

- 산란계의 분과 맹장 소화물에 있는 Salmonella spp. 함량은 Table 2에 나와 있습니다.

- NC처리구 d7에 분에서 가장 높은 Salmonella spp. 의 함량을 보였습니다.(P < 0.05).

- B5 및 B10 처리구는 PC와 비교하여 Salmonella spp.의 더 높은 함량을 보였습니다(P < 0.05).

- d14에서 SGC 처리구는 PC 처리구와 비교하여 더 높은 맹장 및 분에서 Salmonella spp. 함량을 보여주었습니다.

 

 

 

 

- S. Gallinarum의 높은 함량은 분내, 난관, 비장 및 맹장에서 평가되었습니다(Table 3).

- PC처리구는 실험기간동안 S. Gallinarum 음성이었습니다.

- 박테리오파지의 보충은 d3, 7 및 14의 분내에서 S. Gallinarum을 감소시켰습니다(P < 0.01).

- S. Gallinarum은 d7에서 B5보다 B10에서 낮았습니다.

- 박테리오파지의 첨가는 d14에서 난관, 비장 및 맹장에서 감소시켰다(P < 0.01).

 

 

 

 

Immune Organ Size

 

Table 4에서 보는 바와 같이,

- PC처리구에 비하여 S. Gallinarum에 감염된 처리구에서 간의 무게가 더 높게 나타났습니다.

- 박테리오파지 처리 간에는 차이가 없었으며, NC대조구는 PC 및 B10 처리에 비해 상대적으로 비장 무게가 증가한 것으로 나타났습니다.

 

 

 

Gene Expression in Jejunum

 

- PC처리구는 다른 처리구와 비교하여 Jejunum(공장)에서 IL-4, IL-6, IFNg , HSP27, TLR4 및 TNF-α의 mRNA 발현이 가장 낮았습니다(P<0.05, Figure 1).

- SGC처리구 중 NC처리구는 B5에 비해 IL-4 유전자 발현, B5, B10에 비해 IFNg, TLR4, TNF-a 유전자 발현, B10에 비해 HSP27 유전자 발현이 높았습니다.

- B10처리구는 B5처리구와 비교하여 TLR4 및 TNF-a의 mRNA 발현을 감소시켰습니다(P<0.05).

- B5와 B10 사이에 IL-4, IL-6, IFNg 및 HSP27의 유전자 발현에는 차이가 없었습다.

 

 

Gene Expression in Liver

 

- PC처리구는 다른 처리구에 비해 Jejunum(공장)에서 IL-4, IL-6, IFNg , HSP27, TLR4 및 TNF-a의 mRNA 발현이 가장 낮았다(P<0.01, Figure 2).

- SGC처리구에서는 IL-4, IL-6, IFNg 유전자 발현에 차이가 없었으나, NC비교구는 B5 및 B10에 비해 HSP27, TLR4 및 TNF-a의 유전자 발현이 더 높았다.

- B10처리구는 B5처리구에 비해 HSP27의 mRNA 발현이 더 낮았으나(P < 0.05), TLR4와 TNF-a의 유전자 발현에는 차이가 관찰되지 않았다.

 

 

 

Gene Expression in Muscle

- PC처리구는 다른 처리구에 비해 Jejunum(공장)에서 IL-4, IL-6, IFNg , HSP27, TLR4 및 TNF-a의 mRNA 발현이 가장 낮았습다(P < 0.01, Figure 3).

- 공격접종된 처리구에서 IL6의 유전자 발현은 B5에 비해 NC처리구에서 상향조절 되었습니다.

- IFNg 및 HSP27은 B5 및 B10에 비해 NC처리구에서 상향되었으나, TLR4 및 TNF-a의 mRNA 유전자 발현은 영향을 받지 않았습니다.

 

 

 

4. DISCUSSION

 

- 장내에서 장내 미생물군을 통해 면역계에 상당한 영향을 미치는 중요한 기관입니다. (Hosseindoust et al., 2020; Kogut et al., 2020; Huang et al., 2022)

- phase 2에 비해 phase 1에서 Salmonella spp.의 감소는 박테리오파지의 즉각적인 영향 때문일 수 있습니다.

- 박테리오파지는 대부분 항병원성 효과를 가지며 예방및 치료 목적 급여 기간에 걸쳐 더 나은 성능을 나타내는 것으로 제안되었습니다. (Lee et al., 2021)

- 다른 첨가량의 박테리오파지 d14 사이의 분과 맹장에서 Salmonella spp.의 함량 차이가 없다는 것은 phase 2에서 더 낮은 용량으로도 박테리오파지 첨가의 효율성을 보여줄 수 있습니다.

- 더 구체적으로, 연구 결과는 분내 S. Gallinarum의 함량을 급격한 감소로 처리구 사이에서 S. Gallinarum의 수평 전파를 감소시킬 수 있음을 보여줍니다.

- 가금티푸스의는 주로 배설물을 통한 교차 감염을 제거하기 때문에 감염된 계군를 무리에서 제거하는 것입니다.

- 내부장기 중 장, 간, 비장은 S. Gallinarum 증식의 잠재적 병소로 알려져 있습니다. (Da Silva et al., 2016; Zhou et al., 2020)

- 연관되어 공격 접종된 산란계에서 박테리오파지 첨가로 난관, 비장 및 맹장에서 S.Gallinarum의 상대적 감소는 얻어졌습니다.

- 박테리오파지 처리구간의 근소한 차이는 산란계가 질병의 phase 2에서 더 적은 양의 박테리오파지를 필요로 한다는 사실과 관련될 수 있습니다.

- S. Gallinarum은 장 세포에서 순환계로 침투한 후 비장 및 간과 같은 전신 부위로 침투합니다. (Da Silva et al., 2016)

- 내부 장기에서 S. Gallinarum 증식은 면역 체계를 자극하고 염증을 증가시킵니다

 

이러한 S.Gallinarum 감소가 간과 비장과 같은 내부 장기에서 어떻게 관찰되는지 설명하기는 어렵지만, 이 효과를 설명하는 데에는 두 가지 이유가 있을 수 있습니다.

 

첫째, 증식의 주요 부위인 장내 S. Gallinarum을 제거하는 박테리오파지의 역할은 염증 반응을 감소시키고 장기 전신에서 S. Gallinarum을 제거하기 위해 산란계의 면역 체계를 보조할 수 있습니다.

 

둘째, 본 연구에서는 장기 내 박테리오파지의 수를 측정하지 않았지만, 박테리오파지는 살모넬라균에 침투하여 이를 운반체로 사용하여 장기 전신으로 전달되어 타겟 병원체를 제거할 수 있습니다.

 

 

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