NEW BIOTECHNOLOGY OF MICROBIAL PHYTASES

Phytase, a New Life for an “Old" Enzyme

 

 

 

NEW BIOTECHNOLOGY OF MICROBIAL PHYTASES

 

 

위에서 설명한 세 가지 대체 피타제 기술(형질전환 식물, 형질전환 동물, 저피틴성 작물)은 소화 불량에 대처하기 위한 지속 가능한 접근법을 나타냅니다.

단순한 위를 가진 동물에게 피테이트-인을 공급합니다.

그러나 이러한 놀라운 과학적 진보는 낮은 소비자 수용도, 업계의 주저함, 기술적 제약으로 인해 제한적으로 적용되었습니다.

사료를 공급하기 전 사료 피테이트의 화학적 분해를 고려했지만, 이 절차는 사료 품질에 해로울 수 있습니다(106).

피타제 생산 미생물을 동물의 위장관에 접종하는 것도 제안되었습니다.

그러나 이는 미생물에 의한 환경의 식민지화 안정성과 분변 오염에 대한 우려를 불러일으켰습니다.

결과적으로 위에서는 효과적이지만 하부 장에서는 비활성화되는 식이성 미생물 피타제를 보충합니다(107),

이는 실질적으로 편리할 뿐만 아니라 동물 생산 시 사료 피테이트-인과 관련된 문제에 대한 가장 실행 가능한 해결책이 됩니다.

 

 

 

Concept of Ideal Phytase

 

Lei & Stahl(8)은 이상적인 phytase가 최소한 세 가지 특성을 가지고 있다고 제안했습니다.

동물의 상부 소화관에서 phytate-phosphorus을 효과적으로 가수분해하는 능력,

사료 펠릿화의 65-80℃ 온도에 대한 탄력성 및 저렴한 생산 비용.

단일 피타아제가 모든 응용 분야에 이상적일 수는 없기 때문에 돼지, 가금류 및 어류의 피타아제 기능 부위에서 피틴산염 가수분해 조건과 일치하는 용도별 피타아제 배열이 필요하다고 더 제안했습니다.

이상적인 피타제에 대한 탐구는 자연에서 새로운 야생형(WT) 피타제를 식별하는 것과 알려진 피타제에서 원하는 특성을 엔지니어링하는 두 가지 경로를 취했습니다.

 

 

 

 

Identification of Novel Phytases

 

재조합 DNA 기술이 출현하기 전,  novel phytases에 대한 초기 연구는 높은 phytase 활성을 생성하는 미생물을 식별하는 데 중점을 두었습니다.

전략에는 한천 플레이트에서 불용성 피트산염을 가수분해하거나 유일한 인 공급원인 피트산염에서 성장하여 phytase 활성을 스크리닝하는 것이 포함되었습니다.

phytase에 대한 초기 검색 중 가장 주목할 만한 것은 IMC(위 참조)에 의한 검색으로 A. niger(A. ficuum) PhyA를 식별한 것입니다(108).

이 효소는 HAPhy에 속하며 Irving & Cosgrove(53)에 의해 처음으로 2.0과 5.5에서 최적의 이중 모드 pH 프로필을 갖는 것으로 특성화되었습니다.

이후 재조합 DNA 기술의 출현으로 A. niger에서 PhyA의 클로닝 및 과발현이 가능해졌고 이는 상업화되었습니다(54, 55). 다른 리뷰에서는 이전에 확인된 추가 피타제 목록을 작성했습니다(6, 109).

이종 발현 시스템에서 표적 단백질 또는 효소의 과잉 생산에 대한 기술 개발로 인해 새로운 피타제에 대한 초기 검색이 촉매 효율성을 포함한 효소 특성으로 전환되었습니다. pH 프로필; 열안정성; 단백질 분해, 산 및 열에 대한 저항성.

phytase 생산 미생물에 대한 후속 스크리닝을 통해 2세대 상용화된 phytase의 식별 및 특성 분석이 이루어졌습니다(29, 57).

PhyA와 마찬가지로 E. coli phytase AppA 및 AppA2는 HAP 계열에 속하며 어린 돼지의 위와 유사한 pH(3.5)에서 딥(dip) 없이 원하는 pH 프로필로 나타납니다(110).

이 두 박테리아 효소는 또한 높은 활성과 뛰어난 단백질 분해 저항성을 가지고 있습니다(29, 31, 57).

그러나 E. coli phytase는 곰팡이에 비해 열 안정성이 낮았습니다.

다른 상용화된 피타아제는 A. niger 및 P. lycii phytase의 PhyB이며 둘 다 HAPhys이기도 합니다(34, 111).

효모를 포함한 박테리아와 곰팡이에 존재하는 것 외에도 다중 이노시톨 폴리포스페이트 포스파타제라고 불리는 HAPhy는 식물과 동물에서도 발견되었습니다(35, 37, 38).

 

다른 세 가지 주요 피타제 그룹은 우리가 아는 한 상업화되지 않았습니다.

이들은 최적의 pH(산 대 중성/알칼리성), 피트산의 첫 번째 가수분해 탄소 위치(위치 1 또는 3 대 6) 및 구조에 따라 분류될 수 있습니다.

PAPhys는 일반적으로 대두와 같은 식물에서 발견되며 HAPhys보다 활성이 낮습니다(24, 112).

또한 A. niger의 PhyC와 같은 곰팡이에서도 확인되었습니다(113).

피타제의 세 번째 그룹은 PTPhy이며, 그 중 가장 주목할만한 것은 Selenomonas ruminantium입니다(44).

이 피타아제는 HAPhy와 유사한 최적 온도, pH 4~5.5에서 최적 활성, 곰팡이 HAPhy와 유사하지만 박테리아 HAPhy보다는 낮은 촉매 효율을 갖습니다(44, 45).

Bacillus subtilis 및 B. amyloliquefaciens(39, 114)의 BPPhy 계열이 특성화되었습니다(18).

이 종류의 피타아제는 B. subtilis에서 처음으로 확인되었습니다(114, 115).

그 구조는 피테이트 결합에 유리한 정전기적 환경을 조성하는 Ca2+에 대한 의존성을 보여주며, 피테이트를 미오이노시톨-3-포스페이트로 탈인산화시킵니다(116, 117).

HAPhy와 비교하여 이 Bacillus 피타아제는 더 기본적인 pH 프로필, 더 큰 열 안정성 및 칼슘-피테이트 복합체에 대한 더 높은 활성을 나타냅니다(118).

효소 피타아제는 파파인, 판크레아틴, 트립신에도 저항성이 있지만 펩신에는 취약한데, 이는 아마도 낮은 pH에서 단백질 변성 때문일 것입니다(119).

이러한 특성의 조합으로 BPPhy는 장에서 기능하는 데 적합합니다.

대변의 잔여 BPPhy 활동 가능성과 부영양화에 대한 후속 기여를 해결해야 합니다.

BPPhy는 또한 HAPhy에 악영향을 미치는 높은 식이 칼슘 농도로 인해 산란계에서 사용될 수 있습니다(62).

수생 박테리아(120)에 단독으로 존재한다는 것은 양식업에 이점이 있음을 의미할 수 있습니다(121).

Bacillus phytase의 효과는 잉어(118)와 가금류(13)에서 나타났습니다.

그러나 펩신에 대한 BBPhy 민감성이 위 소화를 우회할 만큼 충분한 활동을 허용하는지 여부를 테스트하기 위해 더 많은 수유 실험을 수행해야 합니다.

또한 최적의 pH에서도 BBPhy는 여전히 HAPhy보다 활성이 훨씬 낮습니다.

지난 10년 동안 생명공학 응용을 위한 새로운 피타제 검색에 관한 동료 심사 출판물이 증가했습니다.

이러한 시도에 사용된 유용한 전략은 극한의 열(열안정성이 있을 것으로 예상됨)과 저온(낮은 온도 활동을 가질 것으로 예상됨) 환경에 사는 유기체인 극한미생물에서 피타제를 찾는 것입니다.

예를 들어, 최적 온도가 낮은 피타제는 빙하의 미생물로부터 분리되었습니다(122).

피타아제는 호열성 곰팡이에서도 분리되었습니다(123).

고활성 피타제에 대한 보고도 있었지만(124), 분석 조건의 잠재적인 차이로 인해 주장이 혼동될 수 있습니다(31).

새로 확인된 피타제와 그 생화학적 특성에 대한 포괄적인 요약은 최근 리뷰에서 확인할 수 있습니다(11-13).

Lim et al. (41)은 공개적으로 이용 가능한 서열을 기반으로 phytase 유전자의 다양성을 분석하기 위해 생물정보학 접근법을 사용했습니다.

그들은 BPPhy와 유사한 서열이 식물, 토양 및 수생 박테리아에 존재한다는 것을 발견했습니다.

PTPhy 유사 및 HAPhy 유사 서열은 식물 병원성 및 장내 세균에서 나타났습니다.

자유 생활 박테리아에는 PTPhy와 유사한 서열이 추가로 존재했습니다.

일부 박테리아에는 두 가지 또는 세 가지 유형의 피타제에 대한 서열이 포함되어 있습니다.

예를 들어, Pseudomonas syringae와 Xanthomonas campestri에는 HAPhy, PTPhy 및 BPPhy 유전자가 포함되어 있습니다.

 γ-프로테오박테리아는 피타제 유사 유전자를 보유하는 것으로 가장 많이 보고된 그룹인 것으로 나타났습니다.

식물에 존재하는 것 외에도 PAPhy 유사 서열은 제한된 박테리아 및 시아노박테리아 세트에서도

이들 서열에 대해 검증된 관련 파이타제 활성이 없음에도 불구하고 발견되었습니다(125).

 

 

 

Protein Engineering of Effective Phytases

 

재조합 DNA 기술의 출현으로 인해 단백질 공학은 현장 적용을 위한 효과적인 효소를 개발하는 데 있어 새로운 피타제를 찾는 데 수반되는 접근 방식이 되었습니다.

두 가지 광범위한 전략인 무작위 돌연변이 유발과 합리적 설계가 있으며, 이 두 방법을 결합한 반합리적 설계도 있습니다. 단백질 공학 전략을 묘사하는 흐름도가 최근 리뷰에 제시되었습니다(11).

무작위 돌연변이 유발은 구조적 또는 1차 서열 데이터 가용성과 무관합니다.

이 전략의 특정 절차에는 오류가 발생하기 쉬운 중합효소, 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산의 불균형 또는 과도한 Mn²⁺ 를 통한 오류가 발생하기 쉬운 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 포함됩니다. 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM)(27, 126); 및 상동성 단백질 사이의 유사 영역의 DNA 셔플링.

이러한 전략은 모두 기능적 스크리닝과 결합되어 향상된 특성을 가진 돌연변이를 식별합니다.

합리적인 설계는 일반적으로 정보가 풍부하며 사이트 지정 돌연변이 생성(SDM)을 통해 수행됩니다.

원하는 아미노산-잔기 치환은 구조 및 서열 정보를 기반으로 설계되었으며 단백질의 기능에 특정 영향을 미칠 것으로 예측됩니다.

방법에는 호열성 단백질의 아미노산 잔기 치환, 프롤린 또는 이황화물 다리의 통합 및 염 다리 구축이 포함됩니다.

합리적인 설계는 신중한 구조 분석을 거친 후 단백질별로 수행되는 경우가 많습니다.

반합리적 설계는 구조적 또는 서열 정보를 사용하여 무작위 돌연변이 유발의 효율성을 높이거나 명시적인 근거 없이 변경합니다.

예를 들어, 기능이 알려지지 않은 선택 돌연변이가 서열 정렬을 기반으로 만들어질 수 있거나(127), 서열이 정렬되어 공통 서열을 생성할 수 있습니다(128).

 

• Gene site saturation mutagenesis (GSSM): library-creation method that produces every possible amino acid substitution at every residue throughout an entire gene
• Site-directed mutagenesis (SDM): method to produce targeted amino acid substitution of rational design

 

 

 

 

Function-Targeted Enhancements

 

Phytase공학은 현장 적용에서의 효능을 결정하는 열안정성, pH 활성 프로파일 및 단백질분해효소 저항성과 같은 효소 특성을 개선하는 데 사용되었습니다.

상업적 중요성으로 인해 HAPhy는 Phytase 공학에서 가장 많이 연구된 표적이었으며 이 효소의 열안정성 향상이 주요 목표였습니다.

이러한 공학적 노력으로 A. niger PhyA, E. coli AppA 및 AppA2, 그리고 A. fumigatus Phytase 변종은 열안정성, pH 활성 프로필, 촉매 효율성, 프로테아제 또는 위액 저항성 등 하나 이상의 개선된 특성을 갖게 되었습니다.

원하는 열안정성과 pH 프로필을 갖춘 공통 Phytase의 생성은 Phytase 및 효소 공학의 성공을 강조합니다.

한편, BPPhy에 펩신 저항성 또는 열안정성을 추가하려는 노력이 이루어졌습니다.

 

 

Thermostability.

E. coli AppA2의 열안정성을 높이기 위해 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 85℃에서 15분간 배양한 후 잔류 활성을 기반으로 한 96-well plate screen을 사용했습니다(58).

최고의 돌연변이체는 국소적인 수소 결합이 증가하고 촉매 효율이 약간 향상되어 용융 온도가 6~7°C 증가했습니다.

그러나 확인된 점 돌연변이의 순차적 추가를 목표로 한 후속 연구에서는 AppA2의 열안정성을 추가로 증가시키는 데 실패했습니다(129).

E. coli AppA의 GSSM은 이론적으로 열처리 후 형광 모델 기질을 사용하여 전체 단백질에서 가능한 모든 단일 부위 돌연변이의 라이브러리를 생성하기 위해 수행되었습니다(27).

이 접근법은 통계적으로 가능성이 없는 돌연변이로 인해 잔기 변화의 레퍼토리가 제한되어 있는 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 비해 다소 유리합니다.

8개의 점 돌연변이를 포함하는 결과 Phy9X는 WT에 비해 용융 온도가 12℃ 증가한 것으로 나타났습니다.

이 phytase 변종은 또한 특정 활성의 변화 없이 모의 위액에서 효소의 반감기가 3.5배 증가한 것으로 나타났습니다.

현재 Phy9X는 Quantum Phytase로 판매되고 있습니다(Table 2).

호열성 A. fumigatus에 의해 생성된 동종 Afp 피타제의 잔기 치환을 기반으로 A. niger PhyA의 열안정성을 증가시키기 위한 합리적인 설계가 성공적으로 적용되었습니다(32, 130).

Afp의 기능 상실 돌연변이는 열 안정성을 감소시켰습니다.

PhyA의 기능 획득 돌연변이는 수소 결합과 이온 상호 작용을 증가시켜 WT PhyA보다 7C 더 높은 녹는점(녹는 온도 ¼ 66.3C)을 초래했습니다.

내열성 PhyA의 특정 활성은 기본 형태와 비교하여 변경되지 않았습니다.

피타제의 기능적 표적 강화는 반합리적 설계를 통해 확인된 phytase 서열로부터 공통 피타제의 새로운 합성에 의해 성공적으로 달성되었습니다(128, 131, 132).

최초의 공통 피타아제는 13개의 곰팡이 피타아제fungal phytases의 정렬로부터 생성되었으며,

그 결과 녹는점은 모 피타아제parent phytases보다 15~22°C 높은 78°C였습니다(131).

Consensus phytase-1은 A. fumigatus phytase(30-36 단위/mg)와 비슷한 활성을 보였습니다.

더욱 개선된 공통 피타제-10-열[5] consensus phytase-10-thermo[5]  Q27T, K68A는 6개의 추가 곰팡이 피타제 서열과의 정렬 및 SDM으로 확인된 불안정화 돌연변이 제거를 기반으로 만들어졌습니다.

고급 공통 피타제의 녹는점은 90.4°C로 모체 피타제에 비해 21~42°C 증가했지만 좋은 활성을 유지했습니다(128, 132).

열안정성의 이러한 놀라운 증가는 많은 중간 정도의 안정화 돌연변이(개별적으로 용융 온도를 각각 3℃ 미만으로 증가시킴)의 결합 효과에 기인합니다.

컨센서스 피타제consensus phytase의 섭식 효능 및 용량 의존적 작용은 돼지 실험에서 검증되었습니다(133).

N-결합(질소에 부착된) 글리코실화 부위의 수를 증가시키는 것과 같은 피타제 안정화를 위한 다른 전략도 사용되었습니다.

이는 이황화물 다리(134)의 부주의한 손실과 2차 구조 요소(135, 136)의 교체로 인해 이상하게도 열 안정성을 증가시켰습니다.

한편, 서열 비교를 기반으로 이황화물 가교를 추가하기 위해 BPPhy 엔지니어링을 수행했습니다.

그러나 이러한 수정으로 인해 열안정성은 증가하지 않았습니다(137).

여러 유형의 잔류물을 Pro로 대체하고 Gly를 Ala로 대체하면 활성에 해로운 영향을 주지 않고 열안정성이 성공적으로 증가했습니다(138).

Bacillus phytase의 안정성을 높이기 위해 구조 기반 합의 접근법도 사용되었습니다(139).

 

 

pH-activity profile.

phytases의 pH 프로필도 많은 주목을 받았는데, 왜냐하면 위가 식이 보충 피타제의 주요 기능 부위이기 때문입니다(107, 110, 140).

젖을 뗀 돼지의 위 pH는 종종 pH 3.5에 가까운 반면, 나이든 돼지의 위 pH는 더 산성입니다(140).

가금류의 경우, 보충 phytases는 pH가 5.5에 가까운 작물에서 기능을 발휘할 수 있습니다(141).

그러나 작물에서 phytate 분해는 소화되지 않거나 부분적으로 소화된 사료에 의해 방해될 수 있습니다.

A. fumigatus와 공통 피타제consensus phytase 모두의 최적 pH는 A. niger NRRL 3135의 해당 잔기로 대체하여 감소했습니다(132, 142).

위 조건에서 A. niger PhyA phytase의 기능을 향상시키기 위해 활성 부위의 극성 및 이온 잔기의 전하 상호 작용을 기반으로 한 합리적 설계를 통해 pH 3.5에서의 활성 최저치를 수정했습니다(143).

일부 돌연변이체의 개선된 pH 프로필은 pH 3.5에서 감소된 비활성과 짝을 이루었지만, 돌연변이체 E228K는 향상된 pH 프로파일을 나타냈고 pH 3.5에서 WT의 촉매 효율이 두 배 이상 높았을 뿐만 아니라 pH 5.5에서 향상된 효율을 나타냈습니다.

어린 돼지를 대상으로 한 실험에서 돌연변이 E228K는 WT보다 식이성 피테이트-인phytate-phosphorus 방출에 더 효과적인 것으로 추가로 나타났습니다(143).

A. niger PhyA pH 프로필의 이러한 개선은 이미 설명한 A. fumigatus Afp 잔기의 치환을 기반으로 증가된 열안정성을 초래하는 돌연변이와 호환 가능했습니다(32, 144).

오류가 발생하기 쉬운 PCR 무작위 돌연변이 유발에서 확인된 추가 안정화 돌연변이도 효소에 추가되었습니다.

그 결과 열안정성과 pH 프로필이 함께 향상되었습니다.

이는 합리적인 설계(열안정성 및 pH 프로파일)와 무작위 돌연변이 유발(열안정성)이 상호보완적으로 사용될 수 있음을 보여줍니다.

 

 

Specific activity

절대적으로 보면, 비활성이나 촉매 효율이 pH 프로필보다 더 중요합니다.

A. niger PhyA의 열안정성을 개선하기 위한 모델로서 A. fumigatus Afp를 사용하는 것과 유사하게, A. terreus CBS 피타제는 Afp의 활성을 증가시키는 모델 역할을 했습니다(145).

따라서 두 전략 모두 열에 안정적이고 활성인 효소를 생산할 것입니다.

Afp Q27이 A. terreus CBS 피타제의 상응하는 Leu로 돌연변이되었을 때, 변종은 CBS 피타제의 경우 196 단위/mg 단백질과 비교하여 pH 5.0에서 활성이 27에서 92 단위/mg 단백질로 증가한 것으로 나타났습니다.

이는 제품과의 수소 결합 감소로 인해 발생했으며, 이는 제품 방출의 속도 제한 단계를 촉진했습니다.

그러나 A. niger PhyA의 비활성에 영향을 주지 않고 열안정성을 증가시킨 앞서 언급한 사례와 달리, A. fumigatus Afp의 활성 증가는 녹는점을 6.5℃ 감소시키는 대가로 이루어졌다.

그러나 Afp Q27이 Thr로 돌연변이되었을 때, 변이체는 75 단위/mg의 단백질 활성을 가지며 WT와 동일한 녹는점을 나타냈습니다.

이 돌연변이는 컨센서스 피타제-10 consensus phytase-10의 6개 돌연변이를 추가하여 녹는점을 4.5℃ 증가시켰고, 프로테아제 감수성을 감소시켜 A. fumigatus phytase 13073^hythermo 를 생성하는 consensus phytase-1 및 S126N의 4개 돌연변이를 추가하여 더욱 개선되었습니다(30, 131, 132).

Bacillus phytase의 활성 부위 근처에 양전하를 띤 잔기를 추가하면 활성과 내산성이 향상되었습니다(146).

유사한 접근 방식에서는 A. niger NRRL 3135 PhyA의 치환을 사용하여 공통 피타제-1의 활성 및 pH 프로필을 개선하고 돌연변이 R297Q를 개선하여 공통 피타제-7을 생성하여 A. niger T213의 활성을 3배 증가시켰습니다(147). .

 

 

 

 

Alternative Approaches to Protein Engineering

 

 

상용화된 phytases의 열안정성thermostability을 개선하기 위해 단백질 공학 이외의 접근법이 사용되어 왔습니다.

일반적으로 사용되는 전략 중 하나는 피타제 과립(예: Ronozyme CT 또는 Coated Thermotolerant)에 코팅을 적용하는 것입니다.

그러나 일부 연구에서는 phytase 열내성이 코팅보다는 고유 단백질 특성에 의해 더 많이 좌우된다고 제안합니다(148).

안정화 첨가제의 첨가와 효소 올리고머화도 안정성을 높이기 위해 사용되었습니다(149).

두 번째 전략은 펠릿화 후 냉각된 사료에 액체 phytase 제품을 분사하는 것입니다.

이 대체 공정은 펠렛화 시 열 불활성화에 저항하기 위해 phytase의 고유한 높은 열안정성에 대한 필요성을 제거하는 것처럼 보입니다.

그러나 저장 및 운송 중 phytase의 안정성은 무시되거나 무시될 수 없습니다.

 

 

 

Systems and Efficiency of Phytase Production

 

고체 발효 시스템에서 천연 A. niger에 의한 phytase  발현은 phytase 를 포함하는 천연 효소 혼합물인 Allzyme SSF(Alltech, Table 2)의 상업적 생산에 적용되었습니다.

그러나 대부분의 phytase 는 천연 또는 이종 숙주에서 선택된 유전자를 과발현함으로써 생산됩니다.

A. niger에 의한 PhyA 생산을 위해 천연 과발현이 사용되었습니다(Natuphos, Table 2 ).

이전에 검토한 바와 같이(8),

이종 발현이 진균, 효모, 박테리아 및 식물에서 수행되었습니다.

상용화된 phytase 는 주로 곰팡이와 효모 숙주에서 생산됩니다(Table 2 ).

세균 발현은 봉입체 형성이나 적절한 번역 후 변형 부족으로 인해 제한됩니다.

과잉 생산된 효소의 하류 가공이 필요하거나 사료 펠릿화 시 phytase  활성이 손실되므로 식물 발현이 복잡해집니다.

phytase  단백질 발현을 증가시키기 위해 전통적 및 생명공학적 방법이 적용됩니다.

이전에 검토한 바와 같이(150), 전자에는 수중 발효, 고체 발효, 조작된 배지 성분 및 접종원이 포함됩니다.

후자는 이종 숙주에서 phytase  생산을 증가시키기 위해 사용되었습니다.

코돈Codon 사용법은 원래 phytase  유전자의 공여체와 이종 발현 숙주 사이에 다양하므로, 흔하지 않은 코돈에 대한 tRNA 수준으로 인해 숙주에서 번역이나 단백질 생산이 제한됩니다.

따라서, 숙주의 코돈 선호도와 일치하도록 유전자의 코돈 최적화는 phytase  발현을 향상시킨다(151).

P. pastoris의 경우, 숙주 게놈에 통합된 유전자 카피 수가 증가하면 phytase  발현이 향상되었습니다(152).

세포외 발현을 위한 프로모터 및 리더 신호 펩타이드 서열의 선택은 단백질 발현에 영향을 미쳤습니다.

효모 α -signal  서열은 컨센서스 Kozak 서열을 포함하고 간섭하는 2차 RNA 구조를 최소화하여 MF4I 리더 서열을 생성함으로써 최적화되었으며, 이는 단백질 발현의 14.5배 증가를 가져왔습니다(154).

샤페론chaperone의 동시발현Cooverexpression과 발효 온도의 변화는 또한 효모의 발현 개선을 가져왔습니다(155).

 

 

 

 

Unanswered Questions of Phytase Biotechnology

 

 

이상적인 phytase의 개념을 개발하면서 Lei & Stahl(8)은 특정 요구에 맞게 phytase를 맞춤화할 것을 제안했습니다.

신규하고 조작된 phytase 목록이 증가하고 있음에도 불구하고 상용화 전환은 제한적입니다.

예를 들어, 공통 phytase 생성에 있어서 놀라운 실험실 성공은 10여년 전 산업계의 발전에도 불구하고 새로운 상용 제품의 개발로 이어지지 않았습니다.

양식업을 위한 저온 활성 phytase 개발과 같은 일부 조사 분야는 아직 대부분 미개척 상태로 남아 있습니다.

또 다른 연구 분야는 단백질 재접힘 경로protein-refolding pathways 공학입니다.

90℃에서 열 변성 후 완전히 재접힘되는 A. fumigatus phytase의 능력이 한동안 알려져 있었지만(58),

지속적인 연구에서는 단백질 열안정성에 대한 높은 변성 온도 대비 단백질 재접힘의 기여를 다루지 못했습니다.

마지막으로, 사료 펠릿화를 견딜 수 있는 열안정성과 기타 원하는 특성을 갖춘 허용 가능한 키메라 효소가 아직 생성되지 않았습니다.