Confirmation of Cage Effect and Prebiotic Production Potential of a b-Mannanase, with SBM as Substrate Using Microscopy and Wet Chemistry

 

 

 

SBM에서 b-mannanase가 사료내 세포벽의 가용화 및 mannan oligosaccharides 생성을 조사하기 위해 시험관내 분석 수행 자료

 

이 연구는 상업적인 용량 수준 적용시 효소의 효능을 현미경으로 평가한 최초의 연구입니다.

 

1. Introduction

 

NSP 분해 효소 첨가는 사료에서의 대사 가능한 에너지를 증가시킵니다.

 

가정된 세 가지 주요 작용 모드는 

(1) 가축 소화기간내 점도 감소 

(2) 세포벽을 구성하는 특정 중합체의 가용화에 의한 세포벽 파괴로 캡슐화된 전분/단백질을 방출시키며

(3) 세포벽을 분해하면서 가용성 올리고당의 생성되는 프리바이오틱 효과(Bedford, 2018)

b-mannanases 및 xylanases와 같은 NSP 분해 효소의 첨가는 영양소 소화율을 개선하고 좋은 장내 세균의 수준을 증가시킴으로써 동물 성장 성능을 향상시키는 것으로 보고(Mehri et al., 2010; Lan et al., 2017). 

 

NSPase 제품인 b-mannanase를 사용하여 NSPase의 두 가지 가정 된 작용 모드, 즉 세포벽 분해 또는 쇠퇴효과 및 프리바이오틱 올리고당의 생성을 규명합니다.

 

2. Materials and Methods

 

SBM의 조성 분석은 전분 2.4 %, 단백질 46 %, 지방 1.8 %, 섬유 4 %, 회분 6 %

 

CTCBio Inc. S. Korea CTCzyme은 B. subtilis가 생산하는 상용 단일 성분 β-mannanase 제품로 800,000U/kg mannanase를 사용. 

 

SBM의 샘플은 대조구(효소없이), 1배 또는 10배 투여량으로 CTCzyme을 첨가하여 pH5에서 개별적으로 배양(500g per ton of feed).

 

 

• Embedding and Sectioning
• Immunochemistry for Visualization of Samples Embedded in Paraffin and Staining With Calcofluor 
• Confocal Immunofluorescence Microscopy
• Enzyme Reaction for Wet Chemistry Analyses, Reducing ends assay
• Evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD) using an Agilent 1200 system (Agilent, CA) 

 

 

3. Results

 

이미지는 공 초점 레이저 스캐닝 현미경(a confocal laser scanning microscope,  CLSM)으로 기록되었으며 Alexa-555 형광 트레이서인 fluorescein 신호는 빨간색으로, 단백질자가 형광신호는 녹색, calcofluor 신호는 파란색으로 표시됩니다.

 

Figure 1. Specific b-mannan degradation visualized by immunolocalization with monoclonal antibody LM21.

 

그림1A, SBM was incubated for 4 hours without enzyme

 

그림1B, SBM was incubated for 4 hours with CTCzyme at recommended commercial dosage

 

그림1C SBM was incubated for 4 hours with CTCzyme at 10X recommended commercial dosage

 

그림1A에서 손상되지 않은 세포벽은 Ab LM21을 사용하여 만난(적색)으로 시각화.

 

Calcofluor 염색은 파란색으로 시각화된 셀룰로오스를 염색했습니다.
단백질 몸체는 샘플에서 녹색으로 시각화되었습니다.

효소의 상업적 투여량(1배)을 사용하면 알루론층-AL(그림 1B)을 제외하고 대부분의 만난 신호가 사라졌고, 효소의 10배 투여량으로 처리된 샘플에서 신호가 보이지 않았습니다(그림 1C).
세포벽 구조의 현저한 풀림 및 개방은 상업(그림 1B) 및 enzyme의 10X 투여량(그림 1C) 모두에서 볼 수 있습니다.

 

효소 처리 후,

단일 클론 항체 신호는 아세테이트 완충액 단독으로 배양된 샘플과 비교하여(그림 1B),

검출되지 않았거나(그림 1C) 현저하게 감소했습니다(그림 1A).
단백질을 더 잘 보이게 만드는 효소처리에서 세포벽의 현저한 풀림을 볼 수 있습니다(그림 1B 및 1C).

 

4. Discusssion

 

SBM의 Microscopy는 SBM이 처리될 때 가혹한 조건하(가축 소화기관내)에서도 손상되지 않은 세포벽을 보여줍니다(그림 1A).

 

현미경 데이터는 세포벽에서 만난과 cellulose/xyloglucan의 근접성을 명확하게 보여줍니다(그림 1A).

 

만난 용해는 기름 제거 중에 파괴되지 않는 세포벽 구조를 부분적으로 파괴하는 데 중요합니다(그림 1A).

 

b-mannanase 함유 제품인 CTCzyme에 의한 mannan의 가용화로 인해 콤팩트한 세포벽 구조가 느슨 해지고 세포벽 내의 단백질에 대한 가시적 접근은 상업적 투여량과 10배 투여량에서 모두 볼 수 있습니다(그림 1B 및 1C).

현미경 사진에서 볼 수 있듯이 상업적 투여량의 CTCzyme이 SBM 세포벽에 존재하는 b-mannan을 용해시키는 것이 분명하며, 이는 외인성 또는 내인성 프로테아제에 대한 단백질의 가용성의 증가 가능성이 가장 높습니다.

 

이 결과는 mannan이 SBM 세포벽의 작은 구성 요소이지만(Hsiao et al., 2006; Knudsen, 2014), 가축의 총 소화율에 큰 영향을 미칠 가능성이 높습니다(Ferreira et al., 2016; Kim et al., 2017; Park et al., 2019; Tewoldebrhan et al., 2017).

 

Figure 2. A graphical illustration of what we propose is the effect of the b-mannanase on SBM as substrate based on the microscopy and wet chemistry data obtained; causing disruption of the cell walls in SBM by solubilizing mannan with production of mannan oligomers (MOS) of DP 2 and 4 having a prebiotic effect.

 

 

 

프리바이오틱 효과를 갖는 DP 2 및 4의 mannan oligomers (MOS) 생산으로 만난을 용해시켜 SBM의 세포벽 파괴를 유발함

 

위 그림(Figure 2)에서 반응과정에서 환원당 양의 증가와 mannan oligomers (MOS)형성은 SBM에 대한 효소의 활성과 만난(H-bonded to cellulose and xyloglucan)을 용해시키는 능력을 분명히 나타냅니다(Schröder et al., 2009).

이 연구는 또한 CTCzyme에 의한 SBM에서의 mannan 가용화가 b-mannanase product 단독으로 특정 복합 NSP를 포함하는 세포벽 구조를 파괴하기에 가장 충분하다는 것을 보여줍니다(Ravn et al., 2015), 따라서 다중 효소 제품에 대한 필요성을 완화한다는 것을 보여줍니다.

 

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